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单细胞测序分析喉癌异质性与侵袭转移的关系

孙媛媛中国医科大学-2022

背景

肿瘤异质性的形成主要有两种理论。

扩展：

四项研究

1）分析喉癌及喉癌微环境的异质性，绘制喉癌单细胞图谱

2）分析各组织细胞组成的差异，发现与喉癌侵袭、转移密切相关的恶性细胞亚群。

3）分析上皮源性细胞的拷贝数变异、恶性评分、差异激活的转录因子和信号通路，初步探讨导致恶性肿瘤细胞异质性的机制以及调控喉癌侵袭转移的关键调控因子。

4）分析各免疫细胞亚群的功能及激活信号通路、发育轨迹及关键转录因子，初步揭示喉癌细胞的免疫逃逸机制。

创新点主要结论

1、喉癌微环境复杂，主要由上皮源性细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、髓系细胞、NK细胞、内皮细胞和肿瘤相关成纤维细胞七类组成。上皮源性细胞的异质性与免疫细胞是喉癌异质性的主要原因

2.喉癌细胞存在多种细胞亚群。 其中C6、C8和C11亚群与喉癌的侵袭和转移密切相关。 C4、C5与喉癌细胞的恶性增殖有关。 转移至淋巴组织的肿瘤细胞增殖能力显着增强。

3.喉癌组织呈现免疫抑制状态； 喉癌边缘组织呈现炎症微环境； 淋巴转移癌组织中存在大量记忆T细胞和记忆B细胞，但不发生免疫反应

4、上皮源性细胞与成纤维细胞、髓系细胞关系密切，与T淋巴细胞、B淋巴细胞相互作用较少。

5.上皮来源的细胞具有复杂的拷贝数变异，这是异质性的原因之一。

6. 多种信号通路和转录因子，包括NF-κB和NOTCH，参与喉癌细胞异质性的形成和侵袭转移的调控。

7、在喉癌中，转录因子YY1可以转录激活C-MYC的表达； C-MYC可以直接转录激活HMGB1的表达并促进喉癌细胞的迁移。

8. 喉癌免疫微环境异质性的形成涉及多种信号通路和转录因子，基因调控网络复杂。

关键词： 喉癌； 单细胞测序； 侵袭和转移； 异质性； YY1/C-MYC/HMGB1

第1部分：应用单细胞测序分析喉癌微环境异质性 1.1 实验材料

人喉癌组织（Tumor，T）、边界癌组织（Regions Tumor，R）、正常上皮组织（Normal Tissue，N）及淋巴结转移癌组织（Lymphoid Tissue，L）标本、人喉癌细胞系

1.2 质量控制

10×基因组学要求：

机上细胞悬液细胞总数大于10000个，细胞浓度500~1000个细胞/uL，细胞间无粘附（成簇率

表1.1 3份样本采集情况及患者病理信息

表1.2 细胞悬液上机前的质量控制结果

图1.1 实验流程示意图

图1.2 显微镜下确认单细胞悬液的细胞形态和活性（100×）

单细胞悬液用台盼蓝染色后，在显微镜下观察细胞形态。 活性较好的细胞在显微镜下呈半透明圆圈。

表1.3 cDNA及文库质量检测结果

图1. 3 cDNA及cDNA文库质量检测结果

A、Agilent 2100对cDNA进行质量控制；

B. Agilent 2100 用于 cDNA 文库的质量控制

结果显示，片段检测峰位于450bp左右，无杂质峰。 综上，cDNA测序文库质检合格，Illumina测序可以继续进行。

样本：来自 3 名喉癌患者的 10 个样本（3 T、2 R、3 N 和 2 L）

表1.4 单细胞测序数据质量控制及数据

图1.4 单细胞测序数据质量

A. 过滤前线粒体、UMI和基因的分布

B. 过滤后线粒体、UMI 和基因的分布

图1.5 细胞周期效应评估

A. 细胞周期基因的分布

B. 所有基因的分布

图1.6 单个样本中突变最严重的前2000个基因

1.3 喉癌单细胞异质性分析

图 1.7 喉癌细胞组成和 tSNE 簇可视化

A. 第一降维聚类 t-SNE 图

喉癌组织、交界癌组织、正常组织和淋巴组织中66563个细胞，25个亚群

B.细胞亚群相关性分析：大致分为三类：上皮源性细胞、免疫细胞和基质细胞

C. top3 标记热图

方法：

上皮源性细胞和免疫细胞有多个亚群，细胞数量较多，而基质细胞亚群较少，细胞数量较少。

提示：免疫细胞在喉癌的侵袭和转移中发挥重要作用，基质细胞作用较小。

图1.8 细胞亚群注释和鉴定

A：细胞亚群的t-SNE：25个细胞亚群注释为7种细胞类型，

上皮源性细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞、骨髓细胞、NK细胞、内皮细胞和肿瘤相关成纤维细胞（单R包）

B：每个亚群的单独 t-SNE（Loupe 浏览器软件）

C：组织免疫荧光鉴定：7种细胞以不同比例存在于各组织中

图1.9 喉癌组织细胞的异质亚群

A：二次降维聚类t-SNE图

有12个上皮源性细胞亚群、11个T淋巴细胞亚群、9个B淋巴细胞亚群和7个骨髓细胞亚群。

B：每个亚群的单独 t-SNE

C：各亚群的细胞数、比例、基因数、UMI数

下一步是对每个细胞亚群进行相同的分析。

1.4 上皮源性细胞异质性及其与喉癌侵袭转移的关系

图1.10 上皮源性细胞异质性及功能分析

A：各种组织中的上皮源性细胞亚群和t-SNE图：12个亚群（C0-C11）

B：各组织中上皮源性细胞亚群的百分比及相关图

C：差异标记基因热图

D：GSEA富集分析

总结群克隆软件，

因此，上皮源性细胞在表达谱和功能上存在异质性，每个亚群具有不同程度的分化、增殖、EMT和免疫细胞趋化功能。

具有侵袭和转移能力的细胞亚群具有较强的干性，转移至淋巴组织的肿瘤细胞具有较强的增殖能力。

图1.11 上皮源细胞克隆进化规律分析

A：准年代分析：所有亚群和每个亚群的发育阶段（Monocle软件，探索亚群克隆进化规律）

B：12个上皮源性细胞亚群大致分为4个分化阶段

1.5 T/NK细胞异质性及其在喉癌侵袭转移中的作用

图1.12 T/NK细胞亚群分为11个亚群：

答：5个亚群是CD4T，2个亚群是CD8 T，1个亚群是CMP（common myeloid progenitor，髓样细胞祖细胞），1个亚群是NK细胞和1个γδ T细胞

B：top5标记基因热图

C: 标记基因 t-SNE 图

D：不同组织中各细胞亚群的比例t-SNE图及相关热图

图1.13 T/NK细胞亚群功能富集分析

图1.14 T/NK细胞各亚群发育轨迹分析（准时间顺序分析）：全部及各亚群的发育阶段及具体信息（3类图）

扩展：

T细胞有两种受体：αβ和γδ。 每种类型的受体均由两种蛋白组成，即αβ型受体由α和β蛋白组成，γδ型受体由γ和δ蛋白组成。

95%的T细胞受体由α和β亚基组成，另外5%的T细胞受体由γ和δ亚基组成（这个比例会因个体发育或疾病而改变）

1.6 B细胞异质性及其对喉癌侵袭转移的影响

图1.15 B细胞亚群异质性

答：5个亚群是幼稚B细胞，2个亚群是浆细胞，1个亚群是记忆B细胞，1个亚群是生发中心B细胞。

（球蛋白相关基因，提示浆细胞亚群合成和分泌抗体功能的激活）

B: 标记基因 t-SNE 图

C：top5标记基因热图

D：不同组织中各细胞亚群的比例t-SNE图及相关热图直方图

图1.16 各种B细胞亚群的功能

图1.17 各种B细胞亚群的发育轨迹

总结群克隆软件，

1.7 骨髓细胞异质性及其对喉癌侵袭转移的影响

图1.18 骨髓细胞亚群的组成和异质性

3 个亚群是单核细胞，2 个亚群是巨噬细胞，中性粒细胞亚群和树突细胞亚群各一个

图1.19 骨髓细胞亚群差异分析

图1.20 骨髓细胞亚群的功能富集

图1.21 骨髓细胞亚群的发育轨迹

总结，

1.8 基质细胞对喉癌侵袭转移的影响

图1.22 基质细胞亚群的验证和功能分析

1.9 细胞间通讯网络分析

图1.23 细胞亚群之间的通信网络（CellPhone DB）

A：网络图/热图：配体-受体细胞相互作用的分析结果。 细胞间连接的厚度代表配体-受体的数量。

B：细胞间相互作用的具体分析结果

上皮源性细胞与基质细胞之间存在密切的细胞间通讯，但与免疫细胞的通讯较差（数量较少），这是导致免疫逃避的潜在机制之一。

/待续/

参考：

[1] 封面图片

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