病毒载体被越来越多地用于将基因移至特定组织或诱导细胞类型修饰 。 已经研究了数种病毒在细胞和基因疗法中的用途 ， 其中重组腺相关病毒(rAAV)是最有希望用于基因疗法的载体 。 细胞和基因疗法行业致力于采用现行药品生产质量管理规范(cGMP)进行高效的病毒载体大规模生产 。 为了满足rAAV临床使用的大批量需求 ， 公司正从使用贴壁HEK293细胞生产转变为采用悬浮细胞培养的更具可放大性的技术 。 此外 ， 瞬时转染方案也正在进行优化 ， 以提高悬浮培养的规模和效率 。
在此我们利用实验设计(DoE)方法来优化HEK293T悬浮细胞系统中的rAAV生产 。 经验证 ， 一种高效、可放大的AAV生产的细胞培养工艺—最初使用rAAV2血清型作为rAAV的模型—也可以用于rAVV5 。
我们描述的实验分为两个步骤：首先 ， 我们描述如何使用新细胞培养基进行细胞驯化 。 我们通过这些实验从群体倍增时间(PDT)、形态和活力方面对细胞生长情况进行评价 。 此外 ， 我们的实验设计(DoE)可以评估多种因素的影响 ， 例如质粒浓度、细胞密度和收获时间 。 这些因素可能是未来进行可放大性AAV生产的关键因素（从小规模的摇瓶到25L一次性生物反应器系统） 。 然后我们描述如何优化构成一次性生物反应器的放大AAV生产工艺基础的AAV瞬时转染 。
为了生产rAAV-2 ， 我们使用了三重质粒转染系统为HEK293细胞和变体生产rAAV-2提供所需基因 。 第一种是携带E2A、E4和VA基因的pHelper质粒 。 第二种是用于特定血清型的复制和衣壳(rep/cap)质粒 。 第三种是带有目标基因（GOI–本研究中采用的GFP基因）和反向末端重复序列(ITR)的质粒 ， 用于维持病毒的感染能力（图1） 。

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图1.使用三重质粒转染方法对驯化的HEK293T细胞进行瞬时转染 。 聚乙烯亚胺(PEI)首先与DNA形成复

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图2所示是我们描述的该应用中AAV生产的上游策略 。
图2.我们的策略是开发完整的AAV生产流程；我们在本文中详细介绍了细胞培养和转染的工艺开发 。
详细的材料和方法见文末 。
HEK293T细胞在无血清AAV生产中的驯化
我们使用HyClone?细胞培养转染培养基HyCell?TransFx-H驯化贴壁HEK293T细胞 。 材料和方法中介绍了驯化的详细方案 。 同时 ， 按照相同的策略用同样的培养基成功驯化了HEK293细胞（无SV40大T抗原）（未提供相关数据） 。
将加入高糖和10%HyClone?胎牛血清(FBS)的经典HyClone?DMEM培养基培养的细胞直接移至新的转染培养基中 ， 进行驯化 。 培养基中加入了4mMHyClone?L-谷氨酰胺和0.1%Pluronic?F-68(ThermoFisherScientific?) 。 HEK293T悬浮细胞在相应的无血清培养基中经过10次传代后 ， 我们用显微镜评估了细胞的生长和形态 。 为了避免聚集体的出现和减小剪切力 ， 我们从驯化开始就使用Pluronic?-F68并将细胞密度保持在2.5×106个细胞/mL以下 。
经HyClone?培养基驯化的细胞符合我们设定的成功标准 ， 即<10%聚集（<10个细胞的小聚集体）且细胞生长旺盛 。 我们创建了研究细胞库和工作细胞库（分别为RCB和WCB） 。 从创建的细胞库中解冻HyCell?TransFx-H培养基中的冷冻保存细胞（请参阅材料和方法） 。
细胞库解冻与细胞生长比较
从细胞库中解冻细胞（请参阅材料和方法) ， 进行接种 ， 并每周两次传代培养 。
图3所示为细胞形态的微观结果分析(Evaluation) 。 大多数细胞是活细胞并且处于单细胞悬浮状态 。

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图3.在HyCell?TransFx-H培养基中培养的HEK293T细胞的单细胞悬浮